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感受态细胞制备原理及方法


目前, 感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温(0℃)时处理快速生长的细菌,从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形,外源 DNA 分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面,通过热激作用促进细胞对DNA的吸收、转化效率可达106-107转化子/微克DNA。

操作:

1.取-70℃冰冻菌种,用划线法接种细菌于培养皿,做好标记,于37℃培养过夜。

2.第二天,从平板上挑取单个菌落,接种至含有3ml LB培养液的试管中,37℃振荡培养过夜.次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中,37℃剧烈震荡培养约2~3小时(200~300r/min)。

3.当菌落600nm OD值达到0.3-0.4时,将烧瓶取出放置冰上10~15分钟.在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中.4℃,4000g离心10分钟。

4.弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液.加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中,振荡混匀,悬浮菌体,冰浴30分钟。

5.4℃,4000g离心10分钟,弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液.加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体.每管0.2ml分装,至4℃保存备用,24-48小时内使用效果较好.如果暂时不用,可再保存于-70℃的低温冰箱中。

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